冰冻切片的制备

冰冻组织1一2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。冰冻切片免疫组织化学染色：@晾片将贴有组织的载玻片在空气中晾干，约30min-1h:②漂洗在1XPBS中漂洗3次，每次15min。PHT室温下孵育30min:③一抗孵育将切片放在湿盒内，用滤纸吸干玻片上多余的水分，滴加200μ1一抗工作液，盖好封口膜，4℃孵育过夜，约18h-24h:④漂洗在1XPBS中漂洗3次，每次15min:⑤二抗孵育用滤纸吸干玻片上多余的水分，滴加200μ1二抗工作液，盖好封口膜，4℃孵育过夜：⑥漂洗在1XPBS中避光漂洗3次，每次15min:⑦封片滴加Vectashield防荧光淬灭封片剂在盖玻片上，反转盖玻片，倾斜45。角轻轻放下盖玻片，待封片剂均匀地填充在盖玻片和载玻片之间后用指甲油封固盖玻片四周，指甲油晾干后在荧光显微镜下观察结果。封好的片子在4℃避光保存。或者可先在荧光显微镜下观察结果，再用指甲油封片。操作方法及步骤①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5~10um间.⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。©应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10-15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15~20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。